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產品詳情
操作說明
注意事項
產品描述
細胞凋亡是發(fā)生在胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)過程中的正常生理過程，伴隨著許多形態(tài)學特征改變，其中細胞膜的丟失是細胞凋亡早期的特征之一。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在細胞膜磷脂雙分子層的內側，但在細胞凋亡早期，PS會從脂膜的內側翻轉外側，使其暴露于細胞外側。Annexin V（膜聯(lián)蛋白V）是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS具有高度親和力，會與暴露PS的細胞特異性結合，因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的指標之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過具有完整細胞膜的正常細胞和早期凋亡細胞，但能透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜并將細胞核染色。
本產品通過將EGFP（enhanced Green Fluorescent Protein）與Annexin V組成融合蛋白作為檢測探針，檢測細胞的早期凋亡。同時以PI區(qū)分存活的細胞與壞死、晚期凋亡細胞。Annexin V-EGFP和PI結合使用，活細胞呈現(xiàn)陰性染色（Annexin V-/PI-），早期凋亡細胞呈現(xiàn)單熒光陽性（Annexin V+/PI-），而晚期凋亡細胞和壞死細胞呈現(xiàn)雙熒光陽性（Annexin V+/PI+）。本試劑盒適用于流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。同時由于EGFP與Annexin V是1:1融合，因此本產品還可對凋亡細胞進行定量檢測。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；2-8℃避光保存，12個月有效。
操作步驟
1. 懸浮細胞：取細胞懸液，經500 g，4℃離心5 min收集細胞；
貼壁細胞：先收集細胞培養(yǎng)上清液。然后用不含EDTA的胰酶消化后，與細胞培養(yǎng)上清液合并，經500 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以免過度消化引起假陽性。
2. 用預冷的PBS清洗細胞2次，每次500 g、4℃離心5 min收集細胞；
3. 用預冷的1×Binding Buffer輕柔重懸細胞，調整細胞濃度至1~5×106/mL；
4. 取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-EGFP和5 μL PI，輕柔混勻，室溫避光8-10 min；
5. 加入400 μL預冷的1×Binding Buffer，輕輕搖勻，1 h內用流式細胞儀或者熒光顯微鏡進行檢測。
結果分析
1. 流式細胞儀檢測
a. 流式細胞儀檢測分析時選擇合適的電壓并調好光補償，除實驗組外建議設置陰性對照（不加Annexin V-EGFP和PI標記）用于調節(jié)電壓，單標對照（只加Annexin V-EGFP，以及只加PI的細胞）用于調節(jié)補償；
b. 流式細胞儀檢測分析參考實例：
用5 μM Camptothecin誘導Jurkat T淋巴瘤細胞6 h，參照以上實驗步驟，用流式細胞儀進行檢測，結果如下圖所示。
EGFP最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為507 nm；PI-DNA復合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。經流式細胞儀相關分析軟件繪制雙色散點圖，EGFP位于橫坐標，PI位于縱坐標。在典型實驗中，活細胞無熒光，散點位于左下第一象限。處于早期凋亡細胞有較強的綠色熒光，散點位于右下第二象限。晚期凋亡細胞、壞死細胞呈現(xiàn)紅色、綠色雙重熒光，散點位于右上第三象限。
2. 熒光顯微鏡檢測
在載玻片上加5-10 μL經Annexin V-EGFP和PI雙染的細胞懸液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進行觀察，Annexin V-EGFP呈綠色熒光信號，PI呈紅色熒光信號。
注意事項
1. 整個實驗過程操作應盡量輕柔避免細胞破碎，影響實驗結果。
2. 用PBS清洗細胞不可省略，同時也要盡可能的去掉殘留的PBS。
3. 使用胰酶消化細胞時，應小心操作，避免人為損傷細胞，并控制消化時間。消化時間過短，細胞需用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的機械損傷；若消化時間過長，細胞膜同樣容易受到損傷。影響檢測結果。另外不能使用含EDTA的胰酶，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。
4. 貼壁細胞經凋亡刺激后，如有部分細胞漂浮，需同時收集細胞培養(yǎng)上清液及貼壁細胞合并染色，會使得結果更加準確。
5. Annexin V-EGFP和PI對光敏感，操作時注意避光。反應結束后應盡快進行檢測。
6. 實驗過程中請穿實驗服并戴一次性手套，避免污染，確保安全。
本產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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