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產(chǎn)品詳情
操作說(shuō)明
注意事項
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
目前最常用的蛋白濃度定量檢測方法有兩種，即Bradford法和BCA法。BCA法定量檢測蛋白的基本原理是基于雙縮脲反應，即在堿性條件下，Cu2+被蛋白質(zhì)還原成Cu+，隨后Cu+與BCA（Bicinchonic acid，一種顯色劑）發(fā)生螯合反應，每?jì)煞肿覤CA螯合一個(gè)Cu+，生成紫色的水溶性復合物，該物質(zhì)在562 nm處有最高吸收值，且顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度一定范圍內成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量檢測，蛋白濃度在50-2000 μg/mL濃度范圍內有較好的線(xiàn)性關(guān)系。
本方法不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高濃度的去垢劑，包括濃度高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween-20、60、80等。但螯合劑和高濃度還原劑會(huì )影響檢測結果，需確保樣品中無(wú)EGTA，EDTA濃度低于10 mM，DTT低于1 mM，β-巰基乙醇低于1 mM。
儲存與運輸
整套試劑可常溫運輸；蛋白標準品（BSA）4℃保存，有效期12個(gè)月。配制成蛋白標準溶液后需-20℃保存，并在6個(gè)月內使用。其余試劑常溫保存，有效期12個(gè)月。
操作步驟
1. 配制蛋白標準貯備液：取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長(cháng)期保存。
2. 配制蛋白標準工作液：取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋?zhuān)_保稀釋準確。
3. 繪制標準曲線(xiàn)（酶標儀法）：將蛋白標準工作液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線(xiàn)。
4. 準備待測樣品：將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當稀釋?zhuān)赏ㄟ^(guò)預實(shí)驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線(xiàn)范圍內，確保檢測結果可信），按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5. 配制BCA顯色工作液：將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內使用。每個(gè)待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。
6. 檢測：向標準曲線(xiàn)樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應30 min后，以標準曲線(xiàn)0號做參比，在562 nm波長(cháng)下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應）
7. 計算：以標準曲線(xiàn)中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線(xiàn)。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線(xiàn)上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實(shí)際蛋白濃度。
注意事項
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大，吸光度值會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應的時(shí)間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線(xiàn)。
2. 在進(jìn)行蛋白標準貯備液的配制時(shí)，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋?zhuān)灰淮蜗♂?0倍，以免產(chǎn)生較大誤差。
3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。
4. 操作時(shí)請穿實(shí)驗服，并佩戴一次性手套。
產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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