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Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit

價(jià)格：在線咨詢

貨號(hào)：

FKU0177

產(chǎn)品規(guī)格：

50T

品牌：

萬(wàn)物

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產(chǎn)品詳情操作說(shuō)明注意事項(xiàng)

產(chǎn)品描述

細(xì)胞凋亡是發(fā)生在胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)過(guò)程中的正常生理過(guò)程，伴隨著許多形態(tài)學(xué)特征改變，其中細(xì)胞膜的丟失是細(xì)胞凋亡早期的特征之一。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從脂膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)外側(cè)，使其暴露于細(xì)胞外側(cè)。Annexin V（膜聯(lián)蛋白V）是一種Ca²⁺依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力，會(huì)與暴露PS的細(xì)胞特異性結(jié)合，因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的指標(biāo)之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞，但能透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并將細(xì)胞核染色。

本產(chǎn)品通過(guò)將EGFP（enhanced Green Fluorescent Protein）與Annexin V組成融合蛋白作為檢測(cè)探針，檢測(cè)細(xì)胞的早期凋亡。同時(shí)以PI區(qū)分存活的細(xì)胞與壞死、晚期凋亡細(xì)胞。Annexin V-EGFP和PI結(jié)合使用，活細(xì)胞呈現(xiàn)陰性染色（Annexin V^-/PI^-），早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)單熒光陽(yáng)性（Annexin V⁺/PI^-），而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈現(xiàn)雙熒光陽(yáng)性（Annexin V⁺/PI⁺）。本試劑盒適用于流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。同時(shí)由于EGFP與Annexin V是1:1融合，因此本產(chǎn)品還可對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

冰袋（wet ice）運(yùn)輸；2-8℃避光保存，12個(gè)月有效。

操作步驟

1. 懸浮細(xì)胞：取細(xì)胞懸液，經(jīng)500 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞；

貼壁細(xì)胞：先收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后用不含EDTA的胰酶消化后，與細(xì)胞培養(yǎng)上清液合并，經(jīng)500 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免過(guò)度消化引起假陽(yáng)性。

2. 用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，每次500 g、4℃離心5 min收集細(xì)胞；

3. 用預(yù)冷的1×Binding Buffer輕柔重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1~5×10⁶/mL；

4. 取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-EGFP和5 μL PI，輕柔混勻，室溫避光8-10 min；

5. 加入400 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，輕輕搖勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果分析

1. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

a. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析時(shí)選擇合適的電壓并調(diào)好光補(bǔ)償，除實(shí)驗(yàn)組外建議設(shè)置陰性對(duì)照（不加Annexin V-EGFP和PI標(biāo)記）用于調(diào)節(jié)電壓，單標(biāo)對(duì)照（只加Annexin V-EGFP，以及只加PI的細(xì)胞）用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

b. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析參考實(shí)例：

用5 μM Camptothecin誘導(dǎo)Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞6 h，參照以上實(shí)驗(yàn)步驟，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下圖所示。

EGFP最大激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為615 nm。經(jīng)流式細(xì)胞儀相關(guān)分析軟件繪制雙色散點(diǎn)圖，EGFP位于橫坐標(biāo)，PI位于縱坐標(biāo)。在典型實(shí)驗(yàn)中，活細(xì)胞無(wú)熒光，散點(diǎn)位于左下第一象限。處于早期凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，散點(diǎn)位于右下第二象限。晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色、綠色雙重?zé)晒?，散點(diǎn)位于右上第三象限。

2. 熒光顯微鏡檢測(cè)

在載玻片上加5-10 μL經(jīng)Annexin V-EGFP和PI雙染的細(xì)胞懸液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進(jìn)行觀察，Annexin V-EGFP呈綠色熒光信號(hào)，PI呈紅色熒光信號(hào)。

注意事項(xiàng)

1. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作應(yīng)盡量輕柔避免細(xì)胞破碎，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2. 用PBS清洗細(xì)胞不可省略，同時(shí)也要盡可能的去掉殘留的PBS。

3. 使用胰酶消化細(xì)胞時(shí)，應(yīng)小心操作，避免人為損傷細(xì)胞，并控制消化時(shí)間。消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的機(jī)械損傷；若消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣容易受到損傷。影響檢測(cè)結(jié)果。另外不能使用含EDTA的胰酶，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。

4. 貼壁細(xì)胞經(jīng)凋亡刺激后，如有部分細(xì)胞漂浮，需同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及貼壁細(xì)胞合并染色，會(huì)使得結(jié)果更加準(zhǔn)確。

5. Annexin V-EGFP和PI對(duì)光敏感，操作時(shí)注意避光。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)。

6. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套，避免污染，確保安全。

本產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！

凡合肥萬(wàn)物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問(wèn)，請(qǐng)于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出，并請(qǐng)保證該產(chǎn)品，以備本公司進(jìn)行核對(duì)檢驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對(duì)本公司產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)收。聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價(jià)格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價(jià)格范圍之賠償?？蛻粼谑褂眠^(guò)程中有任何技術(shù)問(wèn)題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時(shí)給予解答。

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