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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項(xiàng)
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品BrdU檢測試劑盒，用于細(xì)胞和組織切片的細(xì)胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，本試劑盒的原理在于，BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測出含有BrdU的細(xì)胞，結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記，可判斷出增殖細(xì)胞的種類、增殖速度等，對研究細(xì)胞動力學(xué)有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入組織細(xì)胞，摻入DNA定位準(zhǔn)確，可有效反應(yīng)S期細(xì)胞新合成DNA的水平，而且受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標(biāo)記不會丟失。
儲存與運(yùn)輸
冰袋（wet ice）運(yùn)輸；破膜液、封閉液（3% BSA）、1 M HCl可4℃保存，4%多聚甲醛可常溫保存，anti-BrdU (mouse mAb)需-20℃保存，有效期12個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 自備PBS緩沖液、二抗、梯度乙醇、封片劑等；
2. 自備細(xì)胞核染色液；
3. 配制anti-BrdU一抗工作液：將anti-BrdU(mouse mAb)用封閉液（3% BSA）稀釋100倍，配制成anti-BrdU一抗工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存；
4. 二抗工作液：根據(jù)檢測需要自備HRP標(biāo)記（后續(xù)經(jīng)白光檢測，配套DAB顯色試劑盒，抗小鼠二抗，并用PBS稀釋配制成二抗工作液。
操作步驟
細(xì)胞樣品：
1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：提前準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，確保細(xì)胞狀態(tài)正常，貼壁良好；
2. BrdU孵育：細(xì)胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，BrdU濃度及細(xì)胞孵育時(shí)間依據(jù)細(xì)胞種類不同，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳條件。注意事項(xiàng)中已測試細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件可供參考；
3. 細(xì)胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5 min。向孔板內(nèi)加入1 mL 4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞，室溫固定20-30 min。PBS洗3次，每次5 min；
4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細(xì)胞處理8-10 min，PBS洗3次，每次5 min；
5. 細(xì)胞核染色（可選）：
若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5 min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5 min；
若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5 min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5 min；
6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1 M HCl覆蓋細(xì)胞，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；
8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30 min。吸棄封閉液，不要清洗；
10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細(xì)胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；
11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1 h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；
12. 封片及鏡檢：
若是HRP標(biāo)記的二抗，則用DAB顯色試劑對細(xì)胞樣品進(jìn)行顯色，脫水，透明，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在潔凈的載玻片上封片，顯微鏡觀察；
若是熒光標(biāo)記的二抗，在潔凈載玻片上滴加抗熒光淬滅封片劑，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察；
組織切片樣品：
1. 動物準(zhǔn)備：需提前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動物，并進(jìn)行體內(nèi)BrdU標(biāo)記，。體內(nèi)標(biāo)記后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行取材、固定及制備石蠟切片；
2. 組織石蠟切片脫蠟復(fù)水；
3. 修復(fù)：組畫筆畫圈圈住組織，將切片浸沒在抗原修復(fù)液中，微波加熱修復(fù)。自然冷卻；
4. 細(xì)胞核染色（可選）：
若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細(xì)胞核：切片入蘇木素染液室溫染色5 min，PBS洗3次，每次5 min；
若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細(xì)胞核：向組織上滴加DAPI染液室溫染色5 min，傾去DAPI染液，切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；
5. 再固定：向組織上滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆蓋組織，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；
7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆蓋組織室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；
8. 內(nèi)源性過氧化物酶淬滅（可選）：向切片上滴加3% H2O2室溫孵育25-30min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。隨后切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；
9. 封閉：向切片上滴加封閉液（3% BSA）覆蓋組織，室溫孵育30 min。去除封閉液，不要清洗；
10. Anti-BrdU抗體孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋組織，4℃孵育過夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；
11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆蓋組織，室溫孵育1 h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；
12. 封片及鏡檢：
若是HRP標(biāo)記的二抗，則用DAB顯色試劑對組織切片進(jìn)行顯色，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察；
若是熒光標(biāo)記的二抗，則滴加抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果觀察
如果用HRP標(biāo)記的二抗檢測，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，增殖細(xì)胞呈棕色。如果是熒光標(biāo)記的二抗，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細(xì)胞為對應(yīng)二抗的熒光。
注意事項(xiàng)
1. 對于細(xì)胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時(shí)間與細(xì)胞種類有關(guān)。一般來說，處理腫瘤細(xì)胞所需濃度和時(shí)間都較低，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞等增殖較慢的細(xì)胞需要提高濃度并延長作用時(shí)間，建議濃度范圍為20-100 μM，作用時(shí)間為40 min-4 h，可根據(jù)具體細(xì)胞的種類進(jìn)行摸索調(diào)整。
下表為測試的常用細(xì)胞處理濃度及時(shí)間，僅供參考。
|
細(xì)胞 |
BrdU濃度（μM） |
孵育時(shí)間（min） |
|
A549 |
40 |
40 |
|
Hela |
40 |
40 |
|
NRK-52e |
40 |
40 |
|
SKOV3 |
80 |
120 |
|
H9C2 |
40 |
40 |
2. 為保證最佳實(shí)驗(yàn)效果，推薦使用本公司生產(chǎn)的其他配套試劑：蘇木素染液(G1004)；DAPI染液(G1012)；DAB顯色試劑盒(G1212），抗熒光淬滅封片劑(G1401)；
3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進(jìn)行核對檢驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價(jià)格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價(jià)格范圍之賠償?？蛻粼谑褂眠^程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時(shí)給予解答。
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