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TSAPLus熒光三重染色試劑盒

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貨號:
KB210523
產(chǎn)品規(guī)格:
50T 25μL
購買數(shù)量:
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產(chǎn)品詳情 操作說明 注意事項

產(chǎn)品簡介

本產(chǎn)品TSAPLus熒光三重染色試劑盒,適用于石蠟切片免疫熒光多重染色,尤其適用于相同來源一抗的多重?zé)晒饷庖邩?biāo)記,也可用于不同來源抗體的多重?zé)晒饷庖邩?biāo)記。主要原理是基于酪胺信號放大(TSA,Tyramide signal amplification),以下簡稱TSA技術(shù)。TSA技術(shù)主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(即熒光標(biāo)記的酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價鍵結(jié)合位點),產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng),該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基)結(jié)合,在抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的熒光素沉積,實現(xiàn)信號放大。本試劑盒使用熒光染料488/555/647對酪胺進行標(biāo)記,得到的熒光酪胺熒光強,信號穩(wěn)定,應(yīng)用于多次重復(fù)免疫標(biāo)記實現(xiàn)多重?zé)晒馊旧?



儲存與運輸

試劑盒內(nèi)各組分按各自所需條件保存,冰袋(wet ice)運輸。12個月有效。


驗前準(zhǔn)備:

1. 自備0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.0-7.4),3% H2O2和0.3% H2O2;

2. 自備一抗及相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗,抗原修復(fù)液(根據(jù)抗體及組織類型選擇合適的抗原修復(fù)液);

3. 根據(jù)用量,按照下表比例配制TSA染色工作液。


TSA染色工作液

試劑名稱

體積

 TSA-488染色工作液

Tyramide稀釋液

1 mL

0.3% H2O2

10 μL

iF488-Tyramide

2 μL

 TSA-555染色工作液

Tyramide稀釋液

1 mL

0.3% H2O2

10 μL

iF555-Tyramide

2 μL

 TSA-647染色工作液

Tyramide稀釋液

1 mL

0.3%H2O2

10 μL

iF647-Tyramide

2 μL

注:熒光Tyramide融化后離心機短時離心,干凈吸頭吹吸混勻后取用。TSA染色工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用,需4℃避光保存,24h內(nèi)有效。


操作步驟

以組織切片為例,以下實驗步驟中的實驗用水均為純水:

1. 組織切片脫蠟至水;

2. 抗原修復(fù):根據(jù)所使用的一抗及樣本類型,采用合適方式對組織切片進行抗原修復(fù)。PBS清洗3次,每次5 min;

3. 用免疫組化筆對組織畫圈標(biāo)記;

4. 向組織滴加100 μL組織自發(fā)熒光淬滅劑A液,室溫孵育30 min,水洗5 min;

5. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶:向切片上滴加3%H2O2覆蓋組織,室溫避光孵育25 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,以減少非特異性背景染色。PBS清洗3次,每次5 min;

6. 封閉:切片水分稍微甩干后,向組織上滴加3%BSA或血清封閉30 min,具體根據(jù)一抗及二抗種屬決定封閉試劑;

7. 一抗孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將一抗稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體,滴加稀釋好的一抗覆蓋組織,切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次,每次5 min;

8. 對應(yīng)HRP二抗孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將二抗稀釋至適當(dāng)濃度,向組織上滴加二抗,室溫孵育50 min。PBS清洗3次,每次5 min;

9. 向組織上滴加50-100 μL TSA-488染色工作液確保完全覆蓋組織,室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min;

10. 微波處理:組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液(根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液)的修復(fù)盒中進行微波加熱處理,去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。

11. 重復(fù)步驟7,進行第二個一抗的孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將需檢測的第二個抗體(一抗)稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體,滴加稀釋好的抗體覆蓋組織,切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次,每次5 min;

12. 重復(fù)步驟8,進行對應(yīng)HRP二抗孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將二抗稀釋至適當(dāng)濃度,向組織上滴加二抗,室溫孵育50 min。PBS清洗3次,每次5 min;

13. 向組織上滴加50-100μL TSA-555染色工作液確保完全覆蓋組織,室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min;

14. 微波處理:組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液(根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復(fù)液)的修復(fù)盒中進行微波加熱處理,去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導(dǎo)致的干片。

15. 重復(fù)步驟7,進行第三個一抗的孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將需檢測的第三個抗體(一抗)稀釋至適當(dāng)濃度。輕輕甩掉切片上的液體,滴加稀釋好的抗體覆蓋組織,切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS清洗3次,每次5 min;

16. 重復(fù)步驟8,進行對應(yīng)HRP二抗孵育:用PBS(或其他抗體稀釋液)將二抗稀釋至適當(dāng)濃度,向組織上滴加二抗,室溫孵育50 min。PBS清洗3次,每次5 min;

17. 向組織上滴加50-100μL TSA-647染色工作液確保完全覆蓋組織,室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min;

18. 細胞核復(fù)染DAPI:切片稍甩干后在組織上滴加DAPI即用型染色液,避光室溫孵育10 min。PBS清洗3次,每次5 min;

19. 組織自發(fā)熒光淬滅:向組織上滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑B液,室溫孵育5 min,流水沖洗3 min;

20. 封片及鏡檢:切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。


注意事項

1. 與熒光二抗相比,TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的信號。因此一抗使用濃度需降低,一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎(chǔ)上再擴大5-10倍,以減少非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景熒光。建議設(shè)置一抗梯度濃度獲得最佳效果。

2. 如背景熒光較強,建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。

3. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500,可根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整稀釋比例(調(diào)整范圍1:200 - 1:1000)。

4. 如進行多重?zé)晒鈽?biāo)記,建議先孵育多抗,后孵育單抗;先孵育低豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體,再孵育高豐度目的蛋白對應(yīng)的抗體。

凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問,請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出,并請保證該產(chǎn)品,以備本公司進行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題,請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量,以便本公司回收產(chǎn)品進行質(zhì)檢,確認產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期,則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進行驗收。 聲明:如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜,本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償,恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償??蛻粼谑褂眠^程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時給予解答。

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