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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項
細胞介紹
通過外植技術(shù)衍生自惡性膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤。
細胞特性
1） 來源：U251膠質(zhì)瘤耐藥篩選
2） 形態(tài)：貼壁細胞
3） 含量：>1×10^6 細胞數(shù)
4） 用途：僅供科研使用。
細胞運輸、保存及注意事項
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復(fù)蘇細胞 |
凍存細胞 |
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包裝 |
充液的T25細胞培養(yǎng)瓶 |
1mL凍存管 |
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運輸條件 |
常溫 |
干冰 |
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保存方式 |
75%酒精消毒瓶壁，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱 |
-80℃冰箱中保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮/立即復(fù)蘇 |
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注意事項 |
1. 收到細胞請先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀、細胞的狀態(tài)，進行拍照并保存，如有問題請及時聯(lián)系我們； 2. 收到的復(fù)蘇細胞，若有較多細胞飄起，可能由于運輸導(dǎo)致。請先置于37℃細胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h，待細胞貼壁后再做處理； 3. 復(fù)蘇細胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，收到細胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基； 4. 建議收到細胞后，首先進行擴增，并凍存部分細胞以備用。 |
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細胞耐藥誘導(dǎo)過程
待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導(dǎo)劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。約8個月后，細胞可在16μg/mL TMZ藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構(gòu)建成功，并命名為U251 MG/TMZ。
細胞培養(yǎng)試劑的配制
1）TMZ藥物的配制及保存
建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其完全溶解。
注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。
2）凍存液的配制
90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3）完全培養(yǎng)基的配制
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成分 |
體積/濃度 |
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優(yōu)質(zhì)胎牛血清 |
10% |
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雙抗 |
1% |
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TMZ |
0~16μg/mL |
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DMEM培養(yǎng)基 |
補充至所需體積 |
細胞培養(yǎng)條件
氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。
細胞處理
1）凍存細胞的復(fù)蘇
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。
注意：①細胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度；
②建議復(fù)蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。
2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）
①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。
②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。
③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。
④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。
⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。
注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度。
3）細胞凍存
①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數(shù)后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10^6 ~ 1×10^7個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
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