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注意事項
細胞介紹
HEK-293T細胞是293T（293tsA1609neo）細胞系（ATCC CRL-11268）的衍生物。細胞持續表達SV40抗原，該細胞常用于轉染實(shí)驗，轉染效率較高。（轉染一般以50%密度鋪板，待細胞剛剛貼到皿壁上后（一般8-10小時(shí)），即可進(jìn)行轉染操作）
細胞特性
1） 來(lái)源：人胚胎腎臟
2） 形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長(cháng)，貼壁能力較弱
3） 含量：>1x10^6 細胞數
4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用。
運輸和保存
干冰運輸及復蘇好存活細胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。
細胞接收后的處理：
1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發(fā)現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀(guān)照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細胞狀態(tài)的依據。
3）半貼細胞和貼壁不牢（懸?。┘毎篢25瓶置于37℃培養箱中約2-3h，顯微鏡下觀(guān)察細胞的情況，若細胞密度在60%以下，客戶(hù)需收集T25瓶中的懸浮細胞離心后用完全培養基重懸后打回到原培養瓶中繼續培養，若細胞生長(cháng)70%-90%對細胞進(jìn)行傳代，傳代時(shí)需要收集培養基中懸浮的細胞離心后回收。
4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來(lái)培養細胞，請換用按照說(shuō)明書(shū)細胞培養條件新配制的完全培養基來(lái)培養細胞。 收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。
一．培養基及培養凍存條件準備：
1） 準備DMEM培養基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA 1% ； 雙抗 1%
注意：1.該細胞貼壁能力較弱，培養時(shí)可酌情使用預鋪0.2%明膠的培養瓶/培養皿。完全培養液中需添加熱滅活胎牛血清。細胞生長(cháng)不能過(guò)密，過(guò)密細胞容易脫落，脫落下來(lái)的細胞可以通過(guò)離心收集，使用0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續培養。
2.如果發(fā)生293T細胞不貼壁，漂浮在培養基中的現象，請確認所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養箱中CO2濃度。并參考以下培養體系：
a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用5％CO2培養箱。
b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用10％CO2培養箱。
當使用碳酸氫鈉含量高的培養基時(shí)，必須將這些細胞在10％CO2中孵育，以便正確緩沖培養基。當培養基沒(méi)有適當緩沖時(shí)，239T細胞雖然可以存活，但將無(wú)法粘附并保持漂浮在培養基中。
2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%FBS，10%DMSO，現用現配。
二． 細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)情況和細胞密度。
2） 細胞傳代：如果細胞密度達70%-90%，即可進(jìn)行傳代培養。
該細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞，傳代可以參考以下方法：
1. 收集：將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會(huì )脫落所以PBS也要回收到離心管中。
2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長(cháng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來(lái)終止消化。
3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來(lái)的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長(cháng)活力，后續傳代根據實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3） 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時(shí)凍存一批細胞種子以備后續實(shí)驗使用。
下面T25瓶為例；
1. 細胞凍存時(shí)按照細胞傳代的過(guò)程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來(lái)決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×10^7個(gè)活細胞/ml.
2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×10^7個(gè)活細胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱(chēng)、代數、日期等信息。
3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。
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