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產(chǎn)品詳情
操作說明
注意事項
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品CY3-Tyramide，為熒光染料CY3標記的酪胺，用于酪胺信號放大技術（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA技術主要原理：在過氧化氫H2O2存在時，辣根過氧化物酶HRP可以催化酪胺為一種非常活躍的短壽命中間體，在短時間內(nèi)，中間體可以共價結合到周圍蛋白的富電子表面形成酪胺化復合物，大量富集成以酶為中心的類似“島”狀的聚集團，因使用熒光染料CY3標記了酪胺，使得抗原-抗體結合部位形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。此外，可以通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)多重熒光染色。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸。
-20℃保存，12個月有效。
操作步驟
以組織切片為例，以下實驗步驟中的實驗用水均為純水，涉及到的試劑均需用戶自備：
1. 組織切片脫蠟至水；
2. 抗原修復：根據(jù)所使用的一抗及樣本類型，采用合適方式對組織切片進行抗原修復。1×PBS清洗3次，每次5 min；
3. 用免疫組化筆對組織畫圈標記；
4. （可選）向組織滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑，室溫孵育30 min，水洗5 min；
5. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：向切片上加入3% H2O2覆蓋組織，室溫避光孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色。1×PBS清洗3次，每次5 min；
6. 封閉：切片水分稍微甩干后，滴加3%BSA或血清封閉30 min。如果一抗是山羊來源，用10%驢血清封閉，其他來源則用3%BSA封閉；
7. 孵育一抗：用1×PBS或封閉液將一抗稀釋至適當濃度。輕輕甩掉切片上的封閉液，滴加稀釋好的一抗覆蓋組織，切片平放于加水的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。1×PBS清洗3次，每次5 min；
8. 孵育HRP標記的二抗：用1×PBS或封閉液將二抗稀釋至適當濃度，向組織上滴加二抗，室溫孵育50 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
9. 配制含0.03‰ H2O2的Tyramide稀釋液：1×TBST 100 mL，加入100 μL 3%H2O2，混勻即可。因H2O2容易分解，本溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
10. 配制TSA染色工作液：用上一步得到的Tyramide稀釋液，將iF555-Tyramide稀釋500倍，即每1 mL Tyramide稀釋液與2 μL CY3-Tyramide混勻，得到TSA染色工作液。每個樣品滴加100 μL染色工作液，室溫避光孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min；
（注：TSA染色工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，需4℃避光保存，24h內(nèi)有效）
11. 微波處理：組織切片置于盛滿抗原修復液（根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復液）的修復盒中進行微波加熱處理，去除已經(jīng)結合的一抗二抗。此步驟中需防止液體過度蒸發(fā)導致的干片。
（注：如需進行雙重或多重熒光染色，則按此步驟往下進行。如不需進行雙重或多重熒光染色，則跳過此步驟，接步驟12進行）
12. 重復步驟7-11，孵育第二個一抗、二抗，以及TSA標記，并微波處理去除一抗、二抗。
13. 細胞核復染DAPI：切片稍甩干后在組織上滴加DAPI染色液，避光室溫孵育10 min。1×PBS清洗3次，每次5 min。
14. （可選）組織自發(fā)熒光淬滅：向組織上滴加自發(fā)熒光淬滅劑，室溫孵育5 min，流水沖洗3 min。
15. 封片及鏡檢：切片稍甩干后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。選擇合適的熒光通道觀察并采集圖像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。
注意事項
1. 本產(chǎn)品室溫融化后，使用離心機進行短暫離心，干凈吸頭吹吸混勻后取用。
2. 與熒光二抗相比，TSA試劑盒有更高的靈敏度和更強的信號。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎上再擴大5-10倍，以減少非特異性結合導致的背景熒光。建議設置一抗梯度濃度獲得最佳效果。
3. 如背景熒光較強，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。
4. 熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500，可根據(jù)實驗結果調(diào)整稀釋比例（建議稀釋比例范圍1:200 - 1:1000）。
5. 如進行多重熒光標記，建議先孵育多抗，后孵育單抗；先孵育低豐度目的蛋白對應的抗體，再孵育高豐度目的蛋白對應的抗體。
6. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。
本產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進行質(zhì)檢，確認產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進行驗收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術問題可以撥打技術售后服務電話我們隨時給予解答。
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