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細胞系細胞株培養構建

來(lái)源:萬(wàn)物   發(fā)布時(shí)間:2021-08-31

1.細胞系

細胞系(cell line)指原代細胞培養物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。 也指可長(cháng)期連續傳代的培養細胞。因此,細胞系狹義的是指可連續傳代的細胞,廣義是指可傳代的細胞。

2.細胞株

通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養物稱(chēng)為細胞株(CellStrain),也就是說(shuō),細胞株是用單細胞分離培養或通過(guò)篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個(gè)培養期間始終存在。

3.細胞培養

細胞培養(cell culture)是指在體外模擬體內環(huán)境(無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養條件等),使之生存、生長(cháng)、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術(shù),在生物學(xué)中的正規名詞為細胞培養技術(shù)。細胞培養技術(shù)可以由一個(gè)細胞經(jīng)過(guò)大量培養成為簡(jiǎn)單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節,而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù),通過(guò)細胞培養既可以獲得大量細胞,又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長(cháng)增殖等。

4.基本過(guò)程

細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術(shù)。細胞凍存在-196℃液氮中,儲存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。

1. 凍存細胞

1)選對數增生期細胞(證明無(wú)支原體污染),在凍存前1d換液。

2)按常規方法把培養細胞制備成懸液,計數,使細胞密度達5×107/ml左右密度,離心,去上清。

3)加入配制好的凍存液(培養液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時(shí)培養液中加入保護劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,可使冰點(diǎn)降低,使細胞內水分在凍結前透出細胞外。

4)分裝于無(wú)菌凍存管中,每管加1.5m懸液。

5)旋好凍存管并仔細檢查,一定要蓋緊,做好標記。

6)凍存:在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時(shí)間內,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度,過(guò)快能影響細胞內水分透出,太慢則促進(jìn)冰晶形成。

操作時(shí)應戴防護眼鏡和手套,以免液氮凍傷。

2. 復蘇細胞

1)從罐中取出凍存管。

2)迅速放入36℃~37℃水浴,不時(shí)搖動(dòng),使其急速融化,30~60s內完成。

3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開(kāi)蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10ml培養液。

4)低速離心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培養液洗一次。

5)用培養液適當稀釋后,裝入培養瓶37℃培養,次日更換一次培養液后,繼續培養。以后仍按常規進(jìn)行培養。

凍存細胞數量要充分,密度應達到107/ml,在融后稀釋20倍時(shí),仍能保持5×105/ml數量

3.傳代培養

1)吸掉或倒掉培養瓶?jì)扰f培養液。

2)向瓶?jì)燃尤胍鹊鞍酌敢汉虴DTA混合液少量。以能覆蓋培養瓶底為宜。

3)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進(jìn)行消化,2~5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察,當發(fā)現胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后,應立即中止消化。

4)吸出消化液,向瓶?jì)燃尤際anks液少量,輕輕轉動(dòng)培養瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養液,終止消化。

5)使用彎頭吸管,吸取瓶?jì)扰囵B液,按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,以防用力過(guò)猛損傷細胞。

6)用計數板計數后,分別接種于新的培養瓶中,置CO2培養箱中進(jìn)行培養。

7)細胞培養換液時(shí)間應根據細胞生長(cháng)的狀態(tài)和實(shí)驗要求來(lái)確定。一般2~3d后應換一次生長(cháng)液。待細胞鋪滿(mǎn)器皿底面,即可使用;也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。

5.注意事項

1)防止細胞交叉污染。

2)細胞污染的預防。


                  


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