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CRISPR/Cas9基因敲除

來(lái)源:萬(wàn)物   發(fā)布時(shí)間:2021-08-31

CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來(lái)自細菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中,CRISPR系統共分成3類(lèi),其中類(lèi)和類(lèi)需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用,而類(lèi)系統只需要一種Cas蛋白即可,這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。

目前,來(lái)自StreptococcuspyogenesCRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個(gè)核酸酶結構域,可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNAtracrRNA結合成復合物,然后通過(guò)PAM序列結合并侵入DNA,形成RNA-DNA復合結構,進(jìn)而對目的DNA雙鏈進(jìn)行切割,使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結構簡(jiǎn)單(5’-NGG-3’),幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點(diǎn),因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經(jīng)成功應用于植物、細菌、酵母、魚(yú)類(lèi)及哺乳動(dòng)物細胞,是目前最高效的基因組編輯系統。

通過(guò)基因工程手段對crRNAtracrRNA進(jìn)行改造,將其連接在一起得到sgRNAsingleguideRNA。融合的RNA具有與野生型RNA類(lèi)似的活力,但因為結構得到了簡(jiǎn)化更方便研究者使用。通過(guò)將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接,得到可以同時(shí)表達兩者的質(zhì)粒,將其轉染細胞,便能夠對目的基因進(jìn)行操作。

作為一種新的基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9有以下特點(diǎn)和優(yōu)勢

1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配,Cas9才會(huì )對DNA進(jìn)行剪切。

2、可實(shí)現對靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除。

3、實(shí)驗周期短,最快僅需2個(gè)月,節省大量時(shí)間和成本。

4、無(wú)物種限制。

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