服務(wù)熱線
400-1016-218
TUNEL
來源：萬物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
TUNEL
一、原理與意義：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。
本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。
二、器材與試劑
1、器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。
2、試劑：試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標(biāo)記的dUTP、標(biāo)記streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；
3、自備試劑：
（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；
（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；
（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；
（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；
（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；
（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）
（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）。
（9）另外，雙蒸水、無菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、蘇木素。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次；
2、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min）；
3、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min；
4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min；
5、浸洗：PBS 5 min×2次；
6、細(xì)胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30）min RT；
7、浸洗：PBS洗5 min；
8、固定：浸入4%多聚甲醛5 min；
9、浸洗：PBS 5 min×2次；
10、平衡：加100 ul平衡液，濕盒平衡10（5~10）min；
11、制備TUNEL反應(yīng)混合液：處理組用1ul rTdT+1ul生物素標(biāo)記的dUTP+98 ul平衡液混勻；而陰性對(duì)照組不加rTdT，改為三蒸水；陽(yáng)性對(duì)照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min，后面步驟從第10步開始。
12、標(biāo)記反應(yīng)：加100ul TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 ℃×1 h。
13、終止反應(yīng)：浸入2×SSC 15 min；
14、浸洗：PBS 5 min×3次；
15、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min；
16、浸洗：PBS 5 min×3次；
17、酶標(biāo)反應(yīng)：加100 ul streptavidin標(biāo)記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min；
18、浸洗：PBS 5 min×3次；
19、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時(shí)。
20、用去離子水沖洗幾次；
21、用蘇木素復(fù)染，3 s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水（50、70、85、95、100、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。
22、加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。
四、注意事項(xiàng)
1、結(jié)果分析時(shí)注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
2、初次檢測(cè)細(xì)胞凋亡，最好設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照片。
3、血細(xì)胞含量高的組織，盡可能延長(zhǎng)過氧化氫的滅活時(shí)間。
4、蘇木素的復(fù)染時(shí)間需要摸索。
5、每片所加試劑可調(diào)整，一般30~100 ul不等，但也要防止液體揮發(fā)而干片，且反應(yīng)均在放置濕盒內(nèi)。
結(jié)果展示：
【一站式整體科研服務(wù)，成就更高水平的科研成果】
標(biāo)書基金實(shí)驗(yàn)咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗(yàn)結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗(yàn)證
實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)文章潤(rùn)色 動(dòng)物模型裸鼠成瘤
臨床檢測(cè)科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作