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電鏡
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
電鏡
電鏡樣品取材方法
1、動物及人體組織的取材
動物組織的取材，應(yīng)在麻醉（1%戊巴比妥鈉按5ml/kg體重腹腔注射）或斷頭急性處死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小塊組織，放在干凈的紙板上，滴一滴冷卻的固定液，用新的、無油污鋒利的（雙面）刀片將材料切成大約1㎜寬，2～3㎜長的小塊，從中挑選損傷小的小條，再將其切成１㎜3的小塊，最后用牙簽將這些小塊逐一放入盛有冷的新鮮固定液的有蓋青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低溫固定（0～4℃）。
2、體外培養(yǎng)細(xì)胞的取材
生長在培養(yǎng)瓶中的體外培養(yǎng)細(xì)胞取材時，先倒出培養(yǎng)液，接著到入適量的戊二醛固定液，在冰浴上放置3～5min，然后用刮刀輕輕刮下瓶壁上的細(xì)胞，將含有細(xì)胞的固定液轉(zhuǎn)移到離心管中，普通離心機(jī)低速離心（2000轉(zhuǎn)/分鐘）15min，使細(xì)胞聚成團(tuán)塊，棄去上清夜，換上新鮮固定液繼續(xù)固定。
3、植物組織的取材
植物組織的取材比較容易，它的細(xì)胞離體后變化不象動物細(xì)胞那樣迅速，但植物細(xì)胞的細(xì)胞壁阻礙著固定液的迅速滲透。因此，植物材料的取材宜切成薄片狀，經(jīng)適當(dāng)固定后再切成小方塊。
電鏡樣品取材的基本要求
1、快取材的動作要迅速，最好在材料離體后１min內(nèi)就進(jìn)入固定液；解剖器械要鋒利，避免牽拉和擠壓，盡量減少取材中的機(jī)械損傷。
2、準(zhǔn)取材要準(zhǔn)確。①器官要準(zhǔn)確；②部位要準(zhǔn)確：如腦垂體的前葉和后葉要分清，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。
3、冷取材過程應(yīng)盡量在低溫下進(jìn)行（0～4℃），以降低酶的活性，減少細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的損失。
4、小所取材料體積要小，一般不超過1㎜3。因為固定劑的滲透力較弱，若組織塊太大，塊的內(nèi)部將得不到良好的固定。
目前常用免疫電鏡標(biāo)本固定液主要有以下幾種。
1、多聚甲醛-戊二醛混合固定液（簡稱PG固定液）推薦用2％～4％ 多聚甲醛與0.5％戊二醛的混合液，固定時間為4 h。
2、過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛混合固定液（稱PLP固定液），固定時間為 6～12 h。該固定液選擇性地固定糖類，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的活性保存較好。低濃度的多聚甲醛能穩(wěn)定蛋白與脂類。
3、苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（稱 PAPG 固定液）含4％多聚甲醛、15％（體積分?jǐn)?shù)）苦味酸（2，4，6，-三硝基苯酚）、0.5％ 戊二醛，pH 7.3?？辔端岽┩噶?qiáng)，對抗原活性影響小。在前固定液中加入苦味酸替代鋨酸，能固定蛋白質(zhì)，改善對膜和胞質(zhì)的保存。常用于包埋后的免疫染色。
實(shí)驗步驟
1、血管灌注固定固定效果最好，能使超微結(jié)構(gòu)得到很好的保存。灌注裝置由加壓氣球、壓力表、三通接頭和連接管道組成。不同的組織器官必須選擇合適的灌注壓力，詳見有關(guān)書籍。灌注固定一般維持 10～15 min。然后用相同的固定液繼續(xù)浸泡固定 2～4 h。
2、浸泡固定組織塊切小后立即投入到固定液中，置于 4℃ 固定 2～4 h。游離培養(yǎng)細(xì)胞離心后去上清，加入 20 倍體積的固定液，用吸管將細(xì)胞團(tuán)塊打散，固定 25～30 min。
3、微波固定微波能加速組織內(nèi)部分子、外部化學(xué)物質(zhì)的運(yùn)動和擴(kuò)散。應(yīng)用微波照射可以縮短固定時間，而且抗原能得到較好保存。一般 700 W 微波照射 10 s，在微波爐內(nèi)放 1000 ml 的冷水以吸收熱量（保持溫度在 35℃ 以下），然后繼續(xù)用固定液固定 2～4 h。
電鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用
1、在細(xì)胞學(xué)方面：由于超薄切片技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，人類利用電鏡對細(xì)胞進(jìn)行了更深入的研究，觀察到了過去無法看清楚的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。例如，用電鏡觀察到了生物膜的三層結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)等。
2、電鏡在發(fā)現(xiàn)和識別病毒方面起到了重要作用：許多病毒，尤其是腫瘤病毒就是用電鏡發(fā)現(xiàn)的。電鏡也為病毒的分類提供了最直觀的依據(jù)，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是首先在電鏡下觀察到并確認(rèn)是病毒而不是支原體的。
3、在臨床病理診斷方面：生物體發(fā)生疾病都會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和功能上的改變，通過對病變區(qū)細(xì)胞的電鏡觀察就可以為疾病診斷提供有力依據(jù)。例如目前電鏡在腎活檢、腫瘤診治中發(fā)揮了重要作用。
4、電鏡技術(shù)與生命科學(xué)中新興起的技術(shù)相結(jié)合，促進(jìn)了新技術(shù)的應(yīng)用。例如電鏡技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生了免疫電鏡技術(shù)，它可以對細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)部的抗原進(jìn)行定位，可以了解抗體合成過程中免疫球蛋白的分布情況等。
結(jié)果展示
【一站式整體科研服務(wù)，成就更高水平的科研成果】
標(biāo)書基金實(shí)驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實(shí)驗結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗證
實(shí)驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作