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免疫共沉淀(Co-IP)

來源:萬物生物   發(fā)布時(shí)間:2021-11-02

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。

其基本原理是,在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的Protein A或G,若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白,就可以形成這樣一種復(fù)合物:“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein A或G”,經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,復(fù)合物又被分開。

然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的,符合體內(nèi)實(shí)際情況,得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。




免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)
(1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);
(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響;
(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
免疫共沉淀缺點(diǎn)
(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;
(2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;
(3)必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預(yù)測不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險(xiǎn)性。
免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程
(1)轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(含蛋白免疫共沉淀酶抑制劑),冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°C, 最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清。
(2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜。
(3)取10 μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3 000 rpm離心3 min。
(4)將預(yù)處理過的10 μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。
(5)免疫沉淀反應(yīng)后,在4°C 以3 000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 ml 裂解緩沖液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘。

(6)SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。




注意的問題:
(1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。
(2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用。
(3)使用對照抗體:
單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗
兔多克隆抗體:正常兔IgG
免疫共沉淀注意的問題
(1)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。
(2) 要確??贵w的特異性,即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。

(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。


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